12:01 10 июня 2020 Наука

Контрацептивные вакцины

Фото: ссылка

Исследования по созданию вакцин, имеющих контрацептивный эффект, ведутся с конца 1920-х гг. С 1972 г. контрацептивные вакцины являются одной из приоритетных программ Всемирной организации здравоохранения (WHO Special Programme of Research, Development and Research Training in Human Reproduction). В осуществлении программы принимает участие Рокфеллеровский фонд (Rockefeller Foundation). Открыто декларируемая цель создания таких вакцин — регуляция численности населения в странах третьего мира. К настоящему времени сложились три основных направления конструирования контрацептивных вакцин: 1) вакцины, ориентированные на блокирование производства гамет; 2) нарушающие их функцию; 3) нарушающие процесс оплодотворения. Контрацептивные вакцины уже более 10 лет широко используются для снижения фертильности и кастрации диких и домашних животных. В коммерческой реализации находятся ветеринарные вакцины Equity®, Improvac®, GonaCon®, Repro-BLOC (на основе гонадторопин-рилизинг-гормона); SpayVacTM и IVT-PZP® (на основе антигенов zona pellucida). Клинические исследования показали эффективное контрацептивное действие (у женщин) вакцин, в которых в качестве антигена используется человеческий хорионический гонадотропин. В то же время обнаружены и побочные действия таких вакцин: для вакцин, содержащих в качестве антигенных компонентов гонадотропин-рилизинг-гормон и лютеинизирующий гормон, — кастрация, развитие импотенции; для содержащих фолликулостимулирующий гормон — олигоспермия; антигены zona pellucida — необратимый оофорит. В работе обсуждаются подходы к обнаружению стерилизующих компонентов в вакцинах, предназначенных для массовой профилактики инфекционных болезней, не заявленных производителями, и последствий их применения. Уже осуществленное скрытое применение контрацептивных вакцин можно предположить: 1) по наличию антител к их антигенным компонентам (у не вакцинированных контрацептивными вакцинами людей таких антител не бывает, за исключением случаев, связанных с бесплодием); 2) по изменению гормонального фона вакцинированного пациента; 3) по нарушению функционирования и патогистологическим изменениям в органах репродуктивной системы.

За рубежом исследования по созданию контрацептивных вакцин для людей ведутся с конца 1920-х гг. В публикациях ученых, разрабатывающих такие вакцины, обычно подчеркивается, что необходимость в них вызвана ростом численности населения планеты, особенно в странах третьего мира. Ряд западных политиков, придерживающихся неомальтузианских взглядов (neo-malthusianism), высказались о необходимости сокращения численности населения путем массовых вакцинаций контрацептивными вакцинами. Цель данной работы — рассмотреть существующие подходы к конструированию контрацептивных вакцин и определить основные признаки, по которым можно распознать их скрытое применение.

История создания контрацептивных вакцин

Началось все в 1899 г., когда австрийский иммунолог Карл Ландштейнер (Karl Landsteiner, 1868–1943) и русский ученый Илья Мечников (1845–1916), работавшие в Институте Пастера (Pasteur Institute, Париж), независимо друг от друга продемонстрировали, что инъекция гетероспецифической спермы может вызывать антительный ответ у экспериментального животного. В 1929 г. Morris J. Baskin, клинический директор Комитета гигиены матерей Денвера (Denver Maternal Hygiene Committee, США), использовал человеческую сперму для временной стерилизации женщин. В 1937 г. им получен патент на неспецифическую спермотоксичную вакцину и способ ее получения . Активным сторонником иммуноконтрацепции был британский ученый, лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине (2010) Роберт Эдвардс (Robert Edwards, 1925–2013), основной разработчик технологии экстракорпорального оплодотворения. С 1972 г. контрацептивные вакцины являются приоритетной программой Всемирной организации здравоохранения (WHO Special Programme of Research, Development and Research Training in Human Reproduction). В осуществлении программы принимает участие Рокфеллеровский фонд (Rockefeller Foundation). До начала 1970-х гг. сперма являлась основным объектом исследований по поиску антигенных детерминант контрацептивных вакцин, предназначенных для людей и животных. За последние 40 лет сложились три основных направления конструирования контрацептивных вакцин:

1) блокирующих образование гамет;

2) нарушающих их функцию;

3) нарушающих формирование зародыша и его имплантацию в матку (нарушающие процесс оплодотворения).

В таблице показан достигнутый уровень конструирования и возможные ограничения для массового применения контрацептивных вакцин.

 двойной клик - редактировать изображение

Основные отличия контрацептивных вакцин от вакцин, используемых для специфической профилактики инфекционных болезней

В 1978 г. V.C. Stevens  сформулировал два основных отличия контрацептивных вакцин от традиционных. Во-первых, антигены контрацептивных вакцин могут быть выбраны только из биологически активных молекул, в норме не вызывающих иммунного ответа. То есть основной задачей разработчиков таких вакцин является либо нарушение иммунологической толерантности к таким молекулам, либо придание им «перекрестной активности» к молекулам, участвующим в репродуктивной функции человека. Во-вторых, контрацептивные вакцины должны блокировать развитие беременности на прогнозируемый период времени.

Гормональная регуляция фертильности человека

В основе регуляции фертильности человека находится действие гонадотропин-рилизинг-гормона (гонадорелин, гонадолиберин, гонадотропин-рилизинг-фактор, gonadotropin-releasing hormone, GnRH; luteinizing-hormone-releasing hormone, LHRH) и индуцируемых им гонадотропных гормонов передней доли гипофиза: фолликулостимулирующего гормона (фоллитропин, follicle stimulating hormone, FSH) и лютеинизирующего гормона (лютеотропин, лютропин, lutropin, lutrophin, luteinizing hormone, LH). GnRH образуется секреторными клетками гипоталамуса (отдел промежуточного мозга). Гипоталамус формирует с гипофизом единый функциональный комплекс. GnRH непосредственно взаимодействует со специфическими рецепторами клеток-гонадотропов, расположенных в передней доле гипофиза, и вызывает усиление секреции FSH и LH. В большей степени GnRH влияет на секрецию лютеинизирующего, чем фолликулостимулирующего гормона. Благодаря действию FSH и LH на гонады GnRH играет важную роль в регуляции репродуктивной функции у человека и животных. Он индуцирует синтез половых стероидных гормонов, сперматогенез и созревание фолликулов, влияет на сексуальное поведение. FSH стимулирует у женщин развитие интерстициальной ткани яичников и овуляцию, что приводит к усиленной секреции женских половых гормонов — эстрогенов. У мужчин FSH вызывает развитие семенных канальцев, стимулирует сперматогенез и секрецию мужских половых гормонов — андрогенов. Действие FSH и LH взаимосвязано и синергично. Под влиянием FSH созревающие фолликулы продуцируют эстрогены, среди которых наибольшее значение имеет эстрадиол. Одновременно FSH индуцирует в фолликулах экспрессию рецепторов к LH. В результате к моменту созревания фолликула уровень эстрадиола становится настолько высоким, что это приводит к активации гипоталамуса (т.е. GnRH) по принципу положительной обратной связи и интенсивному высвобождению LH и FSH гипофизом. Повышение уровня LH запускает овуляцию, при этом из яичника не только высвобождается яйцеклетка, но и инициируется процесс лютеинизации — превращения остаточного фолликула в желтое тело , которое, в свою очередь, начинает вырабатывать прогестерон для подготовки эндометрия к возможной имплантации. LH необходим для поддержания существования желтого тела примерно в течение 14 суток. В случае наступления беременности лютеиновая функция будет поддерживаться действием гормона трофобласта — хорионического гонадотропина (HCG). LH стимулирует клетки в яичниках, продуцирующие андрогены и предшественники эстрадиола. HCG начинает образовываться плацентой плода с первых часов беременности. Его продукция возрастает в несколько тысяч раз к 7–11-й неделе, затем постепенно снижается. Благодаря секреции значительных количеств HCG желтое тело, в норме существующее около 2 недель в течение каждого менструального цикла, у беременных не подвергается рассасыванию и остается функционально активным в течение всего срока беременности. Причем желтое тело у беременных под влиянием HCG производит большие количества прогестерона, физиологически невозможные в норме в небеременном организме. Схема гормональной регуляции фертильности человека приведена на рисунке. 

 двойной клик - редактировать изображение

HCG обладает биологическими свойствами как LH, так и FSH и связывается с обоими типами рецепторов к гонадотропинам. Лютеинизирующая активность у HCG значительно преобладает над фолликулостимулирующей. По лютеинизирующей активности он значительно превосходит «обычный» LH, производимый передней долей гипофиза. Овечьи и человеческие гонадотропины (LH, FSH) структурно сходны между собой. Антитела к этим гормонам обладают перекрестной нейтрализующей активностью.

Вакцины, блокирующие образование гамет

К ним относятся вакцины, блокирующие действие GnRH, FSH и LH. Вакцины на основе гонадотропин-рилизинг-гормона. GnRH представляет собой декапептид с молекулярной массой (ММ) 1182 Да, общий для большинства млекопитающих. Установлена важная роль первых трех аминокислотных остатков в молекуле GnRH для проявления им биологической активности и боковых цепей аминокислотных остатков в положениях 2, 3 и 6 для связывания с рецепторами клеток-гонадотропов. Модификация аминокислот в этих положениях позволила получить высокоактивные и длительно действующие аналоги GnRH. Из-за небольшой ММ и простоты строения молекулы антигенные свойства GnRH минимальны. В некоторых работах его рассматривают как гаптен. Наименьшая ММ веществ, к которым удалось получить антитела без их присоединения к другим, более крупным молекулам, составляет примерно 1000 Да (вазопрессин, ангиотензин). Поэтому конструирование вакцин фертильности на основе GnRH с самого начала пошло по пути повышения его антигенных свойств. В конце 1980-х гг. для решения этой технической задачи использовалось конъюгирование GnRH с иммуностимулирующими носителями, в качестве которых обычно использовали дифтерийный и столбнячный токсоиды, В-субъединицу экзотоксина А псевдомонад (например, с носителем, имеющим ММ до 1 мДа, ковалентно сшивали от двух до семи молекул GnRH), масляные, поликатионные адъюванты, FSH и LH и др. В 1990-х гг. разработчики вакцин фертильности стали увеличивать плотность антигенных эпитопов путем получения методами генной или белковой инженерии мультимерных (до 12 молекул GnRH) или тандемных форм GnRH. Затем их конъюгировали с высокоиммуногенными носителями либо смешивали с эффективными адъювантами, например с полным адъювантом Фрейнда. Открытие в 1997 г. второй формы GnRH, названной GnRH-II (соответственно, первая его форма в тех случаях, когда сравнивается их действие, обозначается как GnRH-I), показало, что управление фертильностью со стороны гипоталамуса является значительно более сложным процессом, чем считалось ранее. GnRH-I и GnRHII синтезируются разными нейронными системами и отличаются друг от друга по антигенным свойствам. Предполагается, что основная роль GnRH-I-нейронов в гаметообразовании заключается в периодической стимуляции синтеза LH (созревание гамет и синтез половых стероидных гормонов), в то время как основная роль GnRH-II-нейронов — преовуляторные выбросы LH. Открытие двух форм GnRH привело к созданию вакцин, представляющих их композиции (GnRHI/GnRH-II). Такие вакцины разрабатываются для лечения рака простаты у людей и кастрации животных. Однако вакцины, включающие иммуностимулирующие носители и адъюванты, имеют ряд серьезных недостатков, проявляющихся при массовом применении. Адъюванты вызывают образование абсцессов и гранулем, иммуностимулирующие носители — эффект доминирования, когда основной иммунный ответ приходится на них. Кроме того, сам процесс образования конъюгатов GnRH и носителей с использованием карбодиимидной реакции трудно предсказуем по получаемым конечным продуктам. Поэтому в прошлом десятилетии сформировались новые направления конструирования GnRH-вакцин:

— введение в антигенную композицию пептидов с эпитопами, распознаваемыми Th-хелперами, — белка F вируса кори, белка CSP возбудителей малярии и др. Такие композиции формировались путем слияния через спейсерную группу пептидов, обладающих выраженными антигенными свойствами, с GnRH;

— использование в качестве антигена белковых структур рецепторов, специфических для GnRH;

— использование в качестве антигена слитых с GnRH гликозилированных белков (устранение эффекта доминирования иммуностимулирующего носителя в иммунном ответе на GnRH).

Наиболее типичной для современных GnRH-вакцин является вакцина Improvac®. В России она свободно продается для ветеринарных нужд. По техническому уровню соответствует разработкам второй половины 1980-х гг. Ветеринарные вакцины GonaCon®, ReproBLOC® отличаются от нее составом адъювантной композиции и схемами применения.

Вакцина Improvac®. Производится Pfizer Inc. В основном используется в свиноводческих хозяйствах для кастрации хряков и получения мяса «без запаха». Одна доза вакцины в качестве действующего вещества содержит 0,4 мг аналога GnRH, конъюгированного с дифтерийным анатоксином, 300 мг ДЭАЭ-декстрана в качестве адъюванта, 0,2 мг тиомерсала в качестве консерванта, мочевину и стерильную воду в качестве вспомогательных веществ. В результате вакцинации в сыворотке крови животного резко понижается уровень тестостерона, LH, FSH, снижается вес и уменьшаются размеры семенников, простаты. Клетки Лейдига  пикнотизируются, их количество сокращается. Нарушается сперматогенез (атипичная форма сперматозоидов, утраты головки, дефекты акросомы и др.). Аналогичные данные получены M. Hilbe et al. Вакцины на основе лютеинизирующего гормона. LH по строению похож на другие гормоны-гликопротеины: тиреотропный гормон, HCG, FSH. Его ММ 28,5 кДа. Гликопротеин представляет собой димерную структуру, состоящую из двух субъединиц — альфа и бета, соединенных двумя дисульфидными мостиками, к каждой из которых присоединены углеводные остатки. Альфа-субъединицы LH, тиреотропного гормона, HCG, FSH идентичны и состоят из 92 аминокислотных остатков. Бета-субъединицы гормонов различаются. Бета-субъединица LH (121 аминокислота) определяет его биологическое действие, специфически взаимодействуя с мембранным рецептором. Она содержит ту же последовательность аминокислот, что и HCG, и стимулирует тот же самый рецептор. Однако HCG имеет 24 дополнительных аминокислоты, и оба гормона существенно отличаются друг от друга своими углеводными компонентами. Различная структура олигосахаридных фрагментов влияет на биологическую активность и скорость разрушения гормонов. Период полураспада LH составляет 20 мин, что короче, чем у FSH (3–4 ч) и HCG (24 ч). Известно о двух направлениях конструирования вакцин на основе LH: 1) в качестве антигенной детерминанты используется его бета-субъединица; 2) в качестве антигенной детерминанты используется наружная часть рецептора клеток, специфически взаимодействующего с LH. Прототипная вакцина создана в средине 1980-х гг. на основе бета-субъединицы LH и полного адъюванта Фрейнда. В опытах на нечеловекообразных приматах было показано ее контрацептивное действие. При вакцинации бычков вакциной на основе конъюгата LH с человеческим сывороточным альбумином достигнуто снижение уровня тестостерона в сыворотке и редукция яичек. Антитела, полученные в результате вакцинации овечьим LH, оказались способными связывать LH приматов (обезьян и людей) и кроликов. При этом количество тестостерона в сыворотке крови через 8–16 нед. после вакцинации снижалось на 90 %, что приводило к азооспермии. Через 15–18 нед. после вакцинации количество сперматид (развивающиеся мужские половые клетки в период спермиогенеза) в популяции уменьшалось более чем на 90 %; сперматоцитов (развивающиеся из сперматогониев мужски половые клетки, предшественники сперматид) — более чем на 50 %. В качестве антигена использовали аминокислотную последовательность рецептора, специфически взаимодействующего с LH на поверхности клетки-мишени. Результаты были получены противоречивые. В последующие годы оба направления конструирования контрацептивных вакцин на основе LH не получили развития. Вакцины на основе фолликулостимулирующего гормона. FSH — гликопротеин с ММ около 30 тыс. Да. Его молекула состоит из двух различных по структуре субъединиц (альфа-FSH и бета-FSH), нековалентно связанных друг с другом. Молекулы FSH человека и разных видов животных обладают значительной гомологией. Бета-цепь специфична для данного гормона, состоит из 118 аминокислотных остатков. Видовых различий в структуре альфа-субъединицы значительно больше, чем в структуре бета-FSH. Углеводная часть FSH составляет около 15 % его ММ и характеризуется гетерогенностью. Каждая из субъединиц FSH содержит по две олигосахаридные цепи, соединенные с полипептидной цепью N-гликозидной связью, образуемой остатками N-ацетилглюкозамина и амидной группой остатков аспарагина. Олигосахаридные цепи необходимы для соединения субъединиц и поддержания надлежащей конформации молекулы. Также они защищают полипептидные цепи субъединиц от расщепления протеолитическими ферментами. Специфические биологические свойства FSH обусловлены бета-субъединицей, приобретающей биологическую активность после соединения с альфа-субъединицей. Большая часть работ по изучению контрацептивной способности вакцин на основе FSH выполнена с использованием гормона овечьего происхождения. Антитела к овечьему FSH перекрестно реагируют с FSH других видов, в том числе и приматов (обезьяны, человек), но не дают перекрестных реакций с человеческим тиреотропным гормоном и LH, имеющим большое сходство по альфа-субъединицам. Толчком к разработкам вакцин на основе FSH стали исследования, выполненные в 1978–1979 гг. У обезьян, вакцинированных овечьим FSH, обнаружили тестикулярную дисфункцию, хотя никаких изменений в концентрации тестостерона в сыворотке крови не происходило. Конструирование вакцин велось по двум направлениям: 1) повышение иммуногенности FSH или его бета-субъединицы (участка бета-субъединицы, содержащего эпитоп, вызывающий образование антител к рецептору гормона), для чего гормон (бета-субъединицу или ее фрагмент) сорбировали на гидроокиси алюминия либо сшивали с дифтерийным анатоксином или натрий-фталат-производным липополисахарида (sodium pthalate derivative of lipopolysaccharide, SPLPS); 2) получение вакцин на основе аминокислотной последовательности рецептора (аминокислоты 1–134), специфически взаимодействующего с FSH на поверхности клеток-мишеней. Сравнительное исследование антигенных свойств интактного FSH и его бета-субъединицы показало, что антитела к FSH обладают на порядок более сильным аффинным сродством, чем антитела к бета-субъединице. Однако N.R. Moudgall, M. Jeyakumar et al. рекомендовали разработчикам контрацептивных вакцин использовать бета-субъединицу с эффективным адъювантом, а не цельный FSH, так как в этом случае на иммунную систему вакцинированного создается меньшая антигенная нагрузка, обусловленная наличием неспецифических эпитопов у альфа-субъединицы гормона. Специфические антитела, образовавшиеся в результате вакцинации, связывают FSH в сыворотке крови до количеств, не определяемых стандартными иммунологическими методами. Контрацепция, развивающаяся в результате вакцинации FSH и белком его рецептора, является следствием ухудшения качества спермы вакцинированного. Вакцинация белком рецептора FSH, выполненная в опытах на самцах обезьян, показала, что бесплодие может быть достигнуто без наступления азооспермии. Блокирование рецептора FSH существенно влияет на пролиферацию сперматогоний и продукцию сперматоцитов, но мейоз, этап, на котором происходит образование сперматид, оно не затрагивает. Благодаря значительному уменьшению количества сперматогоний, доступных для мейотического деления, у вакцинированного значительно уменьшается количество сперматоцитов. В результате у него развивается олигозооспермия, но не азооспермия. Лишение тестикул регуляторного воздействия гипоталамуса, осуществляемого посредством FSH, приводит к появлению в эякуляте незрелых сперматозоидов. Аналогичным образом меняется качество спермы после вакцинации FSH. 

 двойной клик - редактировать изображение

В экспериментах по вакцинации добровольцев овечьим FSH было установлено, что в сыворотке крови не меняется концентрация таких гормонов, как LH, тиреотропный гормон, тестостерон, тироксин, трийодтиронин. FSH (в норме его содержание у мужчин 1–5 нг/мл) может не определяться стандартными иммунологическими методами на пике концентрации специфических антител. Изменения спермы такие же, как у вакцинированных FSH обезьян. Ни первое, ни второе направление конструирования вакцин контрацепции на основе FSH не позволили добиться длительного мужского бесплодия. Вакцинация макак-резусов овечьим FSH привела у них к тяжелым нарушениям сперматогенеза в течение 1–2 лет, однако в течение 4,5 года, несмотря на периодическое повторение вакцинации и олигозооспермию, произошло качественное (но не количественное) восстановление сперматогенеза и фертильности. Причина, почему повторные прививки овечьего FSH не подавили необратимо сперматогенез, осталась неустановленной. При вакцинации рецепторным белком контрацепция оказалась непродолжительной, не более 300 сут., и могла быть достигнута только после двухтрех инъекций антигена с адъювантом. При этом значительно снижалось количество сперматозоидов и их подвижность. Изменения количества тестостерона в сыворотке крови не наблюдалось. Оба направления не получили серьезного развития за последние годы. В более поздней работе R.K. Naz высказано сомнение в перспективности для медицинской контрацепции всего направления создания контрацептивных вакцин, блокирующих образование гамет, в связи с их выраженным влиянием на продукцию стероидных гормонов. По его мнению, такие вакцины широко будут использоваться только в ветеринарной практике для кастрации животных и в терапевтических целях в клинических ситуациях, требующих ингибирования секреции половых стероидов (миома матки, синдром поликистозных яичников, эндометриоз и преждевременное половое созревание — вакцины на основе GnRH и LH).

Вакцины, нарушающие функции гамет

К ним относятся вакцины, нарушающие присоединение сперматозоида к zona pellucida ооцита и блокирующие подвижность и жизнеспособность сперматозоидов. Вакцины на основе антигенов zona pellucida. ZP (ранее называлась zona striata, в русском языке соответствует термин «блестящая оболочка», используемый редко) — прозрачная эластичная гликопротеиновая оболочка вокруг плазматической мембраны яйцеклетки млекопитающих животных и человека. Ее толщина у человека составляет 5–10 мкм. Через нее свободно проникает вода и растворенные в ней вещества, антитела, ферменты и небольшие вирусы. В индивидуальном развитии яйцеклетки ZP образуется на стадии роста, когда она развивается в составе первичного фолликула. Гликопротеины ZP синтезирует яйцеклетка. ZP преимущественно формируют три гликопротеина (ZP1, ZP2 и ZP3), показывающие разную подвижность в полиакриламидном гель-электрофорезе, проводимом в присутствии додецилсульфата натрия (sodium dodecyl sulphate — polyacrylamide gel electrophoresis, SDS — PAGE). В составе ZP человека обнаружены четыре гликопротеина: ZP1, ZP2, ZP3 и ZP4. Классификация гликопротеиновых антигенов ZP формировалась применительно к разным объектам исследования, в разное время, и поэтому в литературе встречаются разные наименования одних и тех же антигенов. Наиболее распространена «мышиная» классификация, ее мы используем в данной работе. Гликопротеины ZP, выделенные из яйцеклеток различных видов млекопитающих, при сходстве структуры самих полипептидов имеют различную подвижность в SDS — PAGE, что является следствием их различной посттрансляционной модификации, включающей гликозилирование. Гликопротеины ZP яйцеклетки человека (human zona pellucidа, hZP) имеют следующую ММ: hZP1 (~100 кДа), hZP2 (~75 кДа), hZP3 (~55 кДа), hZP4 (~65 кДа) [77]. ZP играет основную роль в распознавании и связывании сперматозоида с ооцитом, индукции акросомального эндоцитоза в zona-bound сперматозоида и препятствует проникновению более одного сперматозоида в яйцеклетку, т.е. блокирует полиспермию. ZP2 и ZP3 являются лигандами для рецепторов на головке сперматозоидов, ответственных за связывание с zona pellucida и запуск акросомной реакции. ZP3 индуцирует поглощение сперматозоида яйцеклеткой. После проникновения сперматозоида в яйцеклетке запускается каскад биохимических реакций, приводящий к опорожнению кортикальных везикул — мембранных пузырьков, содержащих литические ферменты. Содержимое кортикальных везикул выбрасывается наружу (в перивителлиновое пространство) и модифицирует zona pellucida таким образом, что последующие сперматозоиды уже не способны проникнуть через нее. Проникновение одного сперматозоида в яйцеклетку — необходимое условие для развития эмбриона. Аминокислотные последовательности белков ZP человека и животных имеют большое сходство между собой. 

 двойной клик - редактировать изображение

Представленные в таблице  данные объясняют гетероспецифичность антител, образующихся к гликопротеинам ZP разных видов животных и человека. Гликопротеины ZP свиньи (porcine zona pellucida, PZP) обычно используются как антигены выбора для изучения контрацептивного действия таких вакцин у людей и приматов. Сравнительные исследования конт рацептивного действия гликопротеинов ZP человека, проведенные на макаках (Macaca fascicularis) и бабуинах (Papio cynocephalus), показали, что наиболее длительной контрацепции (от 9 до 35 мес.) удается достичь при использовании ZP1 в качестве антигенного компонента вакцины. Данное направление конструирования контрацептивных вакцин активно развивалось в 1980-х гг., повторяя те закономерности развития, через которые прошли вакцины, блокирующие образование гамет. В качестве адъювантов использовался полный и неполный адъюванты Фрейнда, сквален, липосомы и др.; в качестве иммуностимулирующего носителя — дифтерийный токсоид. Для получения высокоочищенных препаратов гликопротеинов гены ZP клонировали в эукариотических и прокариотических организмах и на их основе получали продуценты отдельных гликопротеинов. Одновременно накапливались сведения о поствакцинальных осложнениях, развивающихся через несколько месяцев после вакцинации гликопротеинами ZP. Схема представлений о процессе оплодотворения яйцеклетки, в соответствии с которой антитела конкурируют со сперматозоидами за специфические участки на поверхности ZP и тем самыми блокируют его проникновение в яйцеклетку, не учитывала многие другие варианты событий, вызванные активизацией внутриклеточных сигнальных путей. В конце 1980-х гг. было установлено, что у макак, вакцинированных ZP3 яйцеклетки свиньи (50 мкг) в полном адъюванте Фрейнда, достигался длительный контрацептивный эффект (не менее 540 сут. — срок наблюдения) на фоне высоких титров антител к ZP3, но он сопровождался развитием дегенеративных изменений в яичниках. Гистологическое изучение яичников, извлеченных из животных, вакцинированных ZP3 в полном адъюванте Фрейнда, показало заметное снижение количества фолликулов. Яичники в основном содержали первичные фолликулы, расположенные вдоль периферии кортекса. Вторичные фолликулы были значительно меньших размеров, чем в норме. Они выглядели как сотовые агрегаты, связанные через базальную пластинку. Эти остатки фолликулярной ткани находились в процессе рассасывания и были окружены фиброзной соединительной тканью и гиалиновым веществом.  Лейкоцитарной инфильтрации, характерной для хронического воспалительного процесса, не было отмечено. Аналогичные результаты в те годы были получены другими исследователями, но у них оставалась надежда на то, что фолликулярные осложнения вызваны либо действием адъюванта, либо наличием примесей других белков, попавших в вакцину вместе с плохо очищенным первичным сырьем, получаемым исследователями на бойне. С целью получения более гомогенных препаратов гликопротеинов ZP использовали технологию рекомбинантной ДНК. Гены ZP клонировали и переносили в специальные клетки-продуценты, полученный продукт тщательно очищали от примесей других белков и конъюгировали с дифтерийным токсоидом. Но результаты оказались разочаровывающими. Конкуренции со сперматозоидами за специфические участки на поверхности ZP не получилось. Развитие стерильности у вакцинированных собак сопровождалось дегенеративными изменениями яичников. Бабуины (Papio anubis), которым была введена экспериментальная вакцина на основе рекомбинантных обезьяньих (Macaca radiata) ZP1 и ZP2, конъюгированных с дифтерийным токсоидом, остались бесплодными уже после того, как из сыворотки их крови исчезли антитела к этим гликопротеинам. Гистологическое исследование яичников иммунизированных обезьян позволило установить наличие фолликулов, подвергшихся обратному развитию или не достигших зрелости (atretic follicles), и дегенеративные ооциты, что объясняло бесплодие животных в отсутствие антител, специфических к ZP1 и ZP2 [13]. Из ZP-вакцин наибольшее применение в ветеринарной практике нашли SpayVacTM и IVT-PZP (ImmunoVaccine Technologies™, IVT; Галифакс, Новая Шотландия, Канада). Вакцины предназначены для снижения фертильности диких животных, кроме семейства кошачьих. Содержат комплексы гликопротеинов ZP, полученных из яйцеклеток свиней путем водно-тепловой экстракции. В качестве адъюванта преимущественно используется полный адъювант Фрейнда или другие масляные адъюванты. Основное отличие вакцины SpayVacTM от IVT-PZP в том, что у нее антиген включен в липосомы (собственная запатентованная технология). Различаются способы приготовления антигенов, схемы вакцинации и состав адъювантов при первичной и бустерной вакцинациях. Блокируют фертильность животного на период от 22 мес. до 7 лет (в зависимости от вида животного, используемого адъюванта и схемы вакцинации). По техническому уровню соответствуют разработкам второй половины 1980-х гг. В более поздних патентах на контрацептивные вакцины в качестве антигена ImmunoVaccine Technologies™ защищаются гликопротеины ZP, полученные по технологии рекомбинантной ДНК.

Вакцины, блокирующие подвижность и жизнеспособность сперматозоидов

Это направление конструирования вакцин фертильности появилось в конце 1920-х гг. и с тех пор считается исследователями самым перспективным. Причина такого оптимизма заключается: 1) в простоте самой идеи использования белков сперматозоидов в качестве антигенов для вакцинации как мужчин, так и женщин; 2) результатах ранних экспериментов M.J. Baskin, показавшего возможность достижения временного бесплодия у мужчин и женщин, вакцинированных экстрактами спермы; 3) обнаружении антигенных свойств у спермы. Антитела к сперматозоидам обнаруживают у 70 % вазэктомированных мужчин и в 2–30 % случаев семейного бесплодия, ассоциированного с присутствием антител к сперматозоидам у мужчин и/или женщин. Однако ожидания быстрого успеха в создании универсальной контрацептивной вакцины оказались слишком оптимистичны. В конце 1980-х гг. был идентифицирован только 1 % белков сперматозоидов, и еще меньше было известно о том, какие из них доступны для действия антител. По данным Suri Anil и R.K. Naz  наиболее исследованными антигенами сперматозоидов, рассматриваемых специалистами как антигены для вакцин фертильности, являются следующие. SPAG9 (sperm associated antigen 9) — белок с ММ 79 кДа. Видимо, находится в головке сперматозоида, так как специфическая к нему сыворотка склеивает сперматозоиды «головка к головке». Антитела к этому белку обнаружены у бесплодных женщин с нормальными эндокринными профилями и не имеющих сужения маточных труб. Антитела к SPAG9 перекрестно реагируют со спермой многих видов животных. PH-20 (PH-20 antigen) — бифункциональный плазмомембранный белок спермы, обладающий гиалуронидазной активностью. Позволяет акросоме сперматозоида пройти через слой клеток вокруг ооцита и благодаря акросомальной реакции связаться с zona pellucidа. Вакцинация морских свинок обоих полов антигеном PH-20 приводила к бесплодию животных. Впоследствии было показано, что у самцов вместе с бесплодием развивался аутоиммунный орхит, проявлявшийся отсутствием сперматозоидов в придатке яичка. SP-10 — акросомальный специфический белок, обнаруженный в сперматозоидах людей, мышей, лис, обезьян (бабуинов и макак), крупного рогатого скота и свиней. Входит в наружный акросомальный комплекс белков. В эксперименте в условиях in vitro антитела к белку SP-10 блокируют проникновение сперматозоидов в яйцеклетку хомяка. Специфическая лактатдегидрогеназа яичек LDHC4 (testis specific lactate dehydrogenase LDH-C4) — ферментативно активная тетрамерная форма фермента с ММ 140кДа. LDH-C4 изучается уже более двух десятилетий и поэтому хорошо охарактеризована. Считается очень перспективным антигеном для вакцин фертильности данного типа. Однако в экспериментах на яванских макаках, когда использовался конъюгат LDH-C4 с участком молекулы столбнячного токсина, включающим эпитоп для Т-клеток, снизить фертильность вакцинированных животных не удалось.

MDC-белок (metalloprotease/disintegrin/cysteinerich protein) — семейство интегральных мембранных белков, включающих различные по первичной структуре металлопротеиназоподобные домены (metalloproteinase-like domain), также известные как ADAM-семейство белков (ADAM family protein). В , ADAM2),bфертильности играют роль белки семейства, синтезирующиеся в яичках: фертилин бета (fertilin  циритестин (cyritestin, ADAM3; tMDC I), ADAM 5 (tMDC II), ADAM 6, ADAM 16 (xMDC 16), ADAM 18 (tMDC III), ADAM 20, ADAM 21, ADAM 24 (testase 1), ADAM 25 (testase 2), ADAM 26 (testase 3), ADAM 29 и ADAM 30. Пять из белков семейства ADAMs (фертилин бета, циритестин, ADAM 5, ADAM 16, ADAM 18) имеют отношение к процессу оплодотворения яйцеклетки и/или созреванию сперматозоидов. Их основная роль в процессе оплодотворения заключается во взаимодействии между плазматическими мембранами сперматозоида и яйцеклетки. ) — один из первых хорошо охарактеризованных «клеточных дезинтегринов»bФертилин бета (fertilin  (cellular disintegrins). Вызывает слияние сперматозоида и яйцеклетки. Фертилин бета является одной из субъединиц димеризованного антигена спермы (dimeric sperm antigen), который перекрестно реагирует с одним из антител, ингибирующих фертилизацию, известных как PH-30. Фертилин бета и циритестин имеют сходные аминокислотные последовательности. Белок DE (protein DE; acidic epididymal glycoprotein, AEG) — гликопротеин, ММ 37 кДа. В течение эпидидимального созревания (эпидидимальный, т.е. относящийся к придатку яичка) находится в дорсальном регионе головки сперматозоида. Антитела к белку DE/ AEG ингибируют его проникновение в свободную зону яйца (zona free egg). Пептидная последовательность YLP12 (peptide sequence YLP12) — обнаружена в сперме человека и участвует в связывании сперматозоида с яйцеклеткой. Включает 12 аминокислотных последовательностей (YLPVGGLRRIGG). Для исследования контрацептивного эффекта в экспериментах на мышах -субъединицей холерного токсина в качестве b-использовался конъюгат декамера YLP12 с нетоксической  иммуностимулирующего носителя. Конъюгат вводили экспериментальным животным двумя способами: парентерально и интраназально, другие адъюванты не использовались. Оба способа вакцинации оказались эффективными: в сыворотке крови и слизистой влагалища обнаружены антитела, специфически связывающие сперматозоиды. Фертильность животных оказалась полностью подавленной в течение не менее 305–322 сут. после появления в крови антител к декамеру. Антитела к YLP12 обладали контрацептивным действием. Они блокировали капацитацию, акросомальную реакцию и способность сперматозоидов мышей и человека связываться с яйцеклеткой. Пептидные последовательности эпитопов располагались на мембранном белке с ММ 50 кДа, локализованном на акросоме и хвосте сперматозоида. Большинство исследований по вакцинации антигенами сперматозоидов выполнено на мышах. И ни одно из них не дало 100% блокирования фертильности. Максимальное снижение фертильности не превышало 75 %. Существует проблема сопоставимости результатов, полученных на разных экспериментальных моделях. Яичники самок мышей за время одного цикла овуляции производят приблизительно 20–50 ооцитов. У женщин, как правило, созревает одна яйцеклетка на цикл. Следовательно, нет никакой уверенности в том, что достигнутое в экспериментах на мышах снижение фертильности удастся воспроизвести у людей. Для повышения эффективности вакцин, блокирующих подвижность и жизнеспособность сперматозоидов, в последнее десятилетие сформировались два новых направления: 1) повышение мультиэпитопности вакцины, т.е. в качестве антигенов в вакцине используют несколько антигенов сперматозоидов. Появление данного направления свидетельствует об исчерпании возможностей дальнейшего наращивания антигенности моновакцин данного типа путем введения в их состав сильных адъювантов или конъюгирования антигена с иммуностимулирующим носителем; 2) перенесение направления поисков со специфических антигенов сперматозоидов на их уникальные поверхностные структуры, участвующие в биоэнергетических процессах (превращение АТФ в цАМФ, фосфорилирование белков и др.) и обеспечивающие реализацию физиологических функций клеток, в частности, на ионные каналы CatSper, избирательно проницаемые для ионов кальция.

Вакцины, нарушающие формирование зародыша и его имплантацию в матку Вакцины для регуляции фертильности вышеописанных типов (ориентированные на блокирование образования гамет и нарушающие их функцию) создают условия, препятствующие оплодотворению яйцеклетки и превращению ее в зиготу. Однако уже более 40 лет идет разработка вакцин с принципиально иным механизмом снижения фертильности людей — вызывающих прерывание уже развившейся беременности, т.е. аборт. Мишенью разработчиков таких вакцин стали процессы формирования зародыша и имплантации его в матку. В предымплантационном развитии зародыша зигота, сформировавшаяся после оплодотворения яйцеклетки, выполняет серию делений и дифференциаций клеточной структуры (образование морулы, бластулы), в результате чего образуется бластоциста — шар, состоящий из нескольких сотен клеток. Размер бластоцисты у человека 0,1 мм. Бластоциста состоит из двух клеточных популяций: трофобласта (трофэктодермы) и эмбриобласта (внутренней клеточной массы). Трофобласт формирует внешний слой эмбриона — полый шар или пузырек. Эмбриобласт формирует внутренний слой бластоцисты, располагается внутри трофобластатического пузырька в виде скопления клеток у одного из полюсов шара (внутренняя клеточная масса). Трофобласт участвует в имплантации (прикрепление эмбриона к эпителию матки, инвазия внутрь эндометрия матки, иммуносупрессорное действие, разрушение кровеносных сосудов), а также в формировании эктодермы ворсинок хориона (эктодермальная часть плаценты). Эмбриобласт дает начало телу плода, а также мезодермальным и эктодермальным структурам внезародышевых органов (желточному мешку, аллантоису, амниону, мезодермальной части хориона). В формировании зародыша и имплантации его в матку участвуют не менее 76 цитокинов, хемокинов, факторов роста, интегринов и других факторов белковой и гликопротеиновой природы. A.R. Lemons, R.K. Naz  распределили их на пять групп, в зависимости от стадии беременности.

Наибольшие усилия разработчиков вакцин фертильности, вызывающих прерывание беременности, были сосредоточены на вакцине, использующей в качестве антигенного компонента HCG. Данное направление развивается с начала 1970-х гг.. Молекулу HCG формируют 237 аминокислот, ММ 36,7 кДа. По химическому строению он является гликопротеином. Альфа-субъединица HCG полностью гомологична альфа-субъединицам FSH, LH и тиреотропного гормона. Бета-субъединица HCG уникальна именно для него. Поэтому все усилия создать контрацептивные вакцины на основе HCG сосредоточены на бета-субъединице HCG. Конструирование контрацептивных вакцин на основе HCG началось с работ Talwar et al.  и Stevens et al. Первая группа исследователей использовала в качестве антигена целую бета-субъединицу HCG (бета-HCG-вакцина), вторая (пользовавшаяся поддержкой ВОЗ) — ее усеченный вариант (CTP-вакцина; carboxy terminal peptide), соответствующий 37 аминокислотным последовательностям от карбоксильного конца бетаHCG. ММ такого CTP-фрагмента HCG 3 тыс. кДа. Необходимость использования CTP обосновывалась наличием общих участков в первичной структуре HCG и LH. Разработчики вакцин опасались, что антитела к HCG будут блокировать функцию LH (см. выше), 33 аминокислотные последовательности со стороны С-конца HCG не имели сходства с LH. Первую фазу клинических исследований17 CTP-вакцина прошла в конце 1990-х гг. За шесть месяцев наблюдения за вакцинированными женщинами не было выявлено никаких осложнений.

Еще одним подходом к снижению антигенного сходства между бета-субъединицами HCG и LH было частичное нарушение конформации бета-субъединицы HCG. Для этого рассекались и алкилировались три внутрицепочечные дисульфидные группы и полученное производное бета-субъединицы сшивали с иммуностимулирующим носителем. Антигенные свойства HCG снижались, но антигенное сходство с LH утрачивалось полностью. При рассечении всех шести внутрицепочечных дисульфидных связей антигенные свойства HCG утрачивались. Данное направление конструирования HCG-вакцин дальнейшего развития не получило. Бета-субъединица HCG и ее CTP-производные (впоследствии были использованы фрагменты протяженностью в 45 и 53 аминокислоты) оказались слабыми антигенами. Поэтому их сшивали с дифтерийным (DT) и столбнячным (TT) токсоидами и добавляли к адъюванту. Среди иммуностимулирующих носителей наибольшим предпочтением у исследователей пользовался нативный столбнячный токсоид, так как эти вакцины предполагалось использовать и для профилактики столбняка в Индии, где он тогда был широко распространен среди женщин и новорожденных детей. CTP-вакцины использовали вместе с сильными адъювантами (адъювант Фрейнда, сквален, Arlacel A). Значительно большую антигенную активность, чем CTP-вакцины, показали вакцины, включающие целый бета-HCG, сшитый со столбнячным токсоидом и сорбированный на гидроокиси алюминия. Авидность антител к рецептору HCG, вырабатывавшихся в ответ на введение такой вакцины, была на порядок выше, чем у антител, образовавшихся после введения CTPвакцины. Первая фаза клинических исследований бета-HCG-вакцины проведена в конце 1990-х гг. в Финляндии, Швеции, Чили и Бразилии под патронажем International Committee on Contraception Research of the Population Council. У вакцинированных женщин сохранялся регулярный менструальный цикл и овуляция. Отклонений со стороны гормональных и гематологических показателей не отмечено. В то же время выявился серьезный недостаток таких вакцин — большая разница в титрах антител к HCG у вакцинированных, что предполагает вариабельность результатов при массовых вакцинациях. Неудача бета-HCG-вакцины послужила толчком к поиску путей повышения антигенных свойств бетасубъединицы HCG. Эффективным подходом к решению данной задачи стало получение гибридного HCG, состоящего из бета-субъединицы HCG и альфа-субъединицы хорионического гонадотропина овечьего происхождения. Гибрид сшивали со столбнячным токсоидом и сорбировали на гидроокиси алюминия. Вакцина получила обозначение HSD, т.е. гетероспецифический димер (heterospecies dimer). В понимании ее разработчиков вакцинация дала хорошие результаты. Титр антител, препятствующий развитию беременности, сохранялся после каждой бустерной вакцинации в среднем 3 месяца (от 6 недель до 6 месяцев). Женщины восстанавливали фертильность после того, как концентрация антител к HCG в сыворотке крови падала ниже 35 нг/мл. Вакцинация женщин обеими вакцинами, бета-HCG-TT и HSD-TT/DT, приводила к образованию антител, перекрестно реагирующих с человеческим LH. Однако осложнений, связанных с блокированием, LH (см. выше), во время второй фазы клинических исследований, проведенных в Индии в конце 1990-х гг., обнаружено не было. HSD-вакцина считалась в то время лучшей из трех исследованных (CTP-вакцина, бета-HCG-вакцина, HSD-вакцина). Однако до настоящего времени контрацептивные вакцины на основе HCG в коммерческую реализацию не поступили. R.K. Naz объясняет это невозможностью достичь высоких титров антител. Но и высокие титры антител к HCG, когда их удается создать, не решают проблему коммерческой непригодности вакцины. В описании к патенту, опубликованному после завершения второй фазы клинических испытаний такой вакцины в Индии, утверждается, что при высоких титрах антител к HCG они блокируют LH и вызывают образование иммунных комплексов со всеми последующими осложнениями. Сами авторы предлагали контрацептивную вакцину на основе рецептора к HCG, но в последующие годы это направление не получило развития, видимо, из-за его сложности.

Признаки скрытого применения вакцин контрацепции

Сообщения о скрытых массовых вакцинациях контрацептивными вакцинами приходили из Пакистана, Индонезии и стран Латинской Америки. Российское законодательство в области контроля качества иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) построено так, что контролирующая организация на этапе доклинического исследования проверяет препарат по показателям, определенным самим производителем. Качество лекарственного средства — соответствие лекарственного средства требованиям фармакопейной статьи либо в случае ее отсутствия нормативной документации или нормативного документа. Поэтому искать стерилизующий компонент в вакцине никто не будет, если он не заявлен в нормативном документе как один из показателей ее качества (!). Закупки вакцин для массового применения осуществляются по тендеру. Его выигрывает поставщик, предложивший лучшие условия покупателю. Но заподозрить такую вакцинацию все же можно на основании такого косвенного признака, как навязываемые населению репродуктивного возраста под явно надуманными предлогами частые вакцинации и ревакцинации. Антигены, используемые в контрацептивных вакцинах, не дают высоких титров специфических антител на период более 1,5–2 лет. Если в этот промежуток времени не произойдет поражения специфическими антителами органов репродуктивной системы (характерно для вакцин, использующих в качестве антигенов GnRH, LH, FSH, ZP), то фертильность человека восстанавливается. Чтобы этого избежать, под предлогом вакцинации от столбняка женщинам в Никарагуа, на Филиппинах и в Мексике трижды, с промежутками в несколько месяцев вводили вакцину с HCG, конъюгированным со столбнячным анатоксином. Наличие HCG в вакцине подтверждено лабораторными методами исследования. Для реальной профилактики заболевания столбняком введение противостолбнячной вакцины пациенту делается однократно, с временным интервалом не менее 10 лет. Следует знать того, кто стоит за вакцинацией, кто ее инициатор, кто реальный производитель вакцин и состояние его производственных мощностей. Если вакцинацией занимается какая-то неправительственная западная организация, вакцина предлагается бесплатно, в рамках гуманитарной помощи и т.п., то это уже должно настораживать вакцинируемых, так как бесплатных вакцин не бывает, их производство и реализация — весьма прибыльный бизнес; а сама организация-гуманист может оказаться частью сетевой структуры, контролируемой правительством, не желающим огласки. Прямые доказательства скрытого использования контрацептивных вакцин можно получить путем исследования состава вакцин, используемых для массовых вакцинаций населения, и обнаружения в них незаявленных производителем антигенных компонентов, включаемых только в контрацептивные вакцины. Не обязательно, что такие вакцины поступят на рынок в результате саботажа. Возможна халатность или беспринципность, когда дешевая основа вакцины, предназначенной для кастрации хряков, будет продана производителю как основа для дифтерийных и столбнячных вакцин медицинского применения. Уже осуществленное скрытое применение вакцин контрацепции можно предположить по совокупности следующих признаков: 1) наличие в сыворотке крови вакцинированного пациента антител к антигенным компонентам, используемым только в контрацептивных вакцинах, в норме в сыворотке людей антител к таким антигенам не бывает, за исключением случаев, связанных с бесплодием; 2) изменение гормонального фона вакцинированного пациента; 3) нарушения функционирования и патогистологические изменения в органах репродуктивной системы пациента, развившиеся в течение 3 и более месяцев после вакцинации. Сообщения о скрытых массовых вакцинациях контрацептивными вакцинами не являются домыслами «антивакцинаторов» и «исламских фанатиков». Упомянутая в известной книге F. Engdahl  вакцинация населения стран третьего мира осуществлялась вакциной, содержащей в качестве антигена HCG. Но это только одно и не самое опасное направление их конструирования, о чем автор не догадывается. Всего на сегодняшний день развиваются три принципиально различающихся направления создания вакцин фертильности, а в их рамках разрабатывается не менее 12 частных подходов к конструированию таких вакцин. Для проведения массовых вакцинаций населения вакцинами фертильности у сетевых организаций имеются огромные ресурсы: научные — знание тонких механизмов регуляции фертильности человека; организационные — разветвленная сеть фондов и неправительственных организаций; правовые — подогнанная под интересы транснациональных фармацевтических корпораций законодательная база в области оборота лекарственных средств; информационные и коррупционные — примером их объединения можно считать настойчивое нагнетание СМИ атмосферы страха перед псевдопандемиями свиного и птичьего гриппа. Открыто существует и идеологическая база, обосновывающая необходимость массового сокращения населения — неомальтузианство. ВОЗ не является организацией с безукоризненной репутацией. Вакцинация «HCG + столбняк» в странах третьего мира проводилась под эгидой этой организации. Отказаться от такого мощного средства специфической профилактики инфекционных болезней, как вакцинация, нельзя, потому что это приведет к созданию условий для массового распространения инфекционных болезней, сегодня контролируемых вакцинацией. Но и игнорировать возможность использования массовых вакцинаций для скрытой стерилизации населения — значит перестать защищать себя и будущее своих детей и внуков. Необходимо серьезно переосмыслить подходы к доклиническому исследованию ИЛП и восстановить государственный контроль над их производством, существовавший в советское время. Целесообразно запретить ввоз в Россию контрацептивных вакцин ветеринарного назначения, если они содержат в качестве иммуностимулирующего носителя антигены, используемые в вакцинах медицинского назначения.

Михаил Супотницкий 

Источник: журнал «Актуальная инфектология» №1 2014

 

Подписывайтесь на наш канал в Яндекс.Дзен!

Нажмите «Подписаться на канал», чтобы читать «Завтра» в ленте «Яндекса»

Комментарии Написать свой комментарий

К этой статье пока нет комментариев, но вы можете оставить свой

1.0x